1. 1차 배지에서 Staphylococcus 균종이 의심되는 집락이 증식하면 MALDI-TOF 질량분석기로 동정을 시행한다.
2. S. aureus 및 S. epidermidis 균종으로 확인된 균주는 cefoxitin 디스크 확산법 결과에 따라 mecA PCR 및 SCCmec typing을 시행한다. Methicillin 내성인 균주가 mecA 음성인 경우는 mecC PCR을 시행한다. Methicillin 내성-mecA 음성-mecC 음성인 경우는 주관부서에 통보한다.
3. MALDI-TOF 질량 분석기에서 S. intermedius 및 S. pseudintermedius로 확인된 균주는 nuc gene PCR을 시행하여 최종 동정을 시행한다. S. pseudintermedius로 확인된 균주는 oxacillin 디스크 확산법의 결과에 따라 mecA PCR 및 SCCmec typing을 시행한다. Methicillin 내성인 균주가 mecA 음성인 경우는 mecC PCR을 시행한다. Methicillin 내성-mecA 음성-mecC 음성인 경우는 주관부서에 통보한다.
4. Staphylococcus 균종은 SCCmec type의 비교를 위해 S. aureus의 SCCmec typing 방법을 사용하는 것을 원칙으로 한다, 하지만 S. epidermidis 및 S. pseudintermedius 에 해당하는 균주의 SCCmec typing이 불가능한 경우는 whole genome sequencing을 통하여 SCCmec type을 확인한다.

1. SCCmec type은 ccr 유전자의 종류와 mec gene complex의 조합에 따라 SCCmec type이 결정된다.
2. ccr multiplex PCR 결과에 따라 ccr 유전자의 종류를 결정한다.
3. mec gene complex muliplex PCR 결과에 따라 mec gene complex 종류를 결정한다.
4. ccr 유전형과 mec gene 유전형을 조합하여 SCCmec 유전형을 결정한다.

1. E. coli 및 K. pneumoniae
   • 가) 1차 배지에서 의심 집락이 증식하면 MALDI-TOF 질량분석기로 동정을 시행한다.
   • 나) E. coli 및 K. pneumoniae로 확인된 균주는 항생제 감수성 결과에 따라 ESBL 생성 의심 균주, PABL (Plasmid-mediated AmpC β-lactamase) 생성 의심 균주 및 CPE 의심 균주로 분류한다.
   • 다) 의심되는 내성의 양상에 따라 ESBL double disk synergy 검사 및 CarbaNP 또는 mCIM 추가 감수성 시험을 시행하고, 내성 유전자 PCR 및 염기서열분석을 시행한다(시험 균주에 따라 추가 감수성 시험은 생략할 수 있다).
   • 라) BMD로 시행한 colistin 감수성 시험에서 MIC ≥ 4 μg/mL이면 mcr(mobile colistin resistance)에 대한 PCR을 시행한다.
2. Citrobacter 균종 및 Enterobacter 균종
   • 가) 1차 배지에서 의심 집락이 증식하면 MALDI-TOF 질량분석기로 동정을 시행한다.
   • 나) Citrobacter 균종 및 Enterobacter 균종으로 확인된 균주는 항생제 감수성 결과에 따라 ESBL 생성 의심 균주 및 CPE 의심 균주로 분류한다. Citrobacter 균종과 Enterobacter 균종은 유전자에 ampC β-lactamase를 가지고 있으므로 PABL은 시험하지 않는다.
   • 다) 의심되는 내성의 양상에 따라 ESBL double disk synergy 검사 및 carbaNP 또는 mCIM 추가 감수성 시험을 시행하고, 내성 유전자 PCR 및 염기서열분석을 시행한다(시험 균주에 따라 추가 감수성 시험은 생략할 수 있다).
   • 라) BMD로 시행한 colistin 감수성 시험에서 MIC ≥ 4 μg/mL이면 mcr (mobile colistin resistance)에 대한 PCR을 시행한다.
3. Salmonella 균종 및 Shigella 균종
   • 가) 1차 배지에서 의심 집락이 증식하면 항혈청, MALDI-TOF 질량분석기 또는 자동화 장비로 동정을 시행한다.
   • 나) Salmonella 균종 및 Shigella 균종으로 확인된 균주는 항생제 감수성 결과에 따라 ESBL 생성 의심 균주로 분류하고 추가 감수성 시험 (Double disk synergy), ESBL PCR 및 염기서열 분석을 시행한다.
   • 다) Salmonella 균종에서 quinolone 내성이 의심되는 경우는 QRDR (quinolone-resistance determining region)에 대한 염기서열분석을 시행한다.
   • 라) BMD로 시행한 colistin 감수성 시험에서 MIC ≥ 4 μg/mL이면 mcr (mobile colistin resistance)에 대한 PCR을 시행한다.

1. Double disk synergy 시험
   • ① 하룻밤 배양한 시험 대상 균주를 사용하여 0.5 McF 균액을 만들고, 디스크 확산법 검사와 같은 방법으로 MHA에 접종한다.
   • ② 배지의 정중앙에 clavulanic acid 또는 clavulanic acid가 포함된 항생제 디스크를 놓는다.
   • ③ Clavulanic acid 디스크를 중심으로 클로버 모양으로 cetotaxime, ceftazidime 또는 cefepime 디스크를 디스크 가장 자리가 1.5-2 cm 간격이 되도록 놓는다.
   • ④ 35℃±2℃에서 18-24시간 동안 배양한다.
   • ⑤ Clavulanic acid와 cefotaxime, ceftazidime 또는 cefepime 디스크 간에 억제대의 증폭이 있으면 양성으로 판정한다.
     
     | Figure Ⅴ-4 | Cefepime과 amoxicillin-clavulanic acid 디스크를 사용한 double disk synergy 시험 결과
     파란색 원은 억제대의 변화가 없음을 나타내고 붉은 색 원은 억제대의 증폭이 발생하여 ESBL 양성임을 나타낸다.
2. Carba NP 시험 (Rapiddec Carba NP, bioMerieux, Marcy Eʼtolile, France)
   • ① 2개의 microcentrifuge tube에 라벨을 표기한다(a 및 b).
   • ② 각 tube에 100 μL의 bacterial protein extraction 용액을 각각 넣는다.
   • ③ 하룻밤 배양한 시험 대상 균주를 1 μL 루프 (1/1000 백금이)를 사용하여 각각의 tube에 접종하고 5초간 vortex로 혼합한다.
   • ④ 시험 용액 A와 B를 각각의 라벨이 붙은 tube에 접종한다(상용 시약).
   • ⑤ vortex를 사용하여 tube를 잘 혼합한다.
   • ⑥ 35℃±2℃에서 2시간 동안 배양한다.
   • ⑦ 판독한다 (시약 매뉴얼 참조)
3. Modified carbapenem inactivation method (mCIM)
   • ① 하룻밤 배양한 시험 대상 균주를 1 μL 루프 (1/1000 백금이)를 사용하여 2 mL TSB에 접종한다.
   • ② 10-15초간 vortex를 사용하여 혼합한다.
   • ③ 10 μg meroepenem 디스크를 멸균된 기구 (forcep)를 사용하여 균액 (세균이 접종된 2 mL TSB)에 완전히 잠기도록 넣는다.
   • ④ 35℃±2℃에서 4시간±15분 동안 배양한다.
   • ⑤ E. coli ATCC 25922 표준 균주를 사용하여 0.5 McF 탁도의 균액을 준비한다.
   • ⑥ 준비된 E. coli ATCC 25922 균액은 15분 이내에 MHA 한천 배지에 접종하고 3-10분간 배지를 건조시킨다.
   • ⑦ 다)에서 사용한 TSB에서 meropenem 디스크를 무균법으로 꺼내어 바)에서 준비한 배지에 디스크 확산법 검사하는 것처럼 접종한다.
   • ⑧ 35℃±2℃에서 18-24시간 배양한다.
   • ⑨ 15 mm 이하의 억제대가 생기거나 16-18 mm 영역에 집락이 형성되면 carbapenemase 양성으로 판정한다.

Carbapenem에 대해서 중간이거나 내성인 균주 및 BMD로 시행한 감수성 시험에서 MIC ≥ 4 μg/mL

Carbapenem에 대해서 중간이거나 내성인 균주 및 BMD로 시행한 감수성 시험에서 MIC ≥ 4 μg/mL일 때 시행

Carbapenem에 대해서 중간이거나 내성인 균주 및 BMD로 시행한 감수성 시험에서 MIC ≥ 4 μg/mL일 때 시행